Principios y métodos de análisis cuantitativo por cromatografía líquida.

El mecanismo de separación de la cromatografía líquida se basa en la diferencia en la afinidad de los componentes de la mezcla por las dos fases.

Según las diferentes fases estacionarias, la cromatografía líquida se divide en cromatografía líquido-sólido, cromatografía líquido-líquido y cromatografía en fase unida.Las más utilizadas son la cromatografía líquido-sólido con gel de sílice como carga y la cromatografía en fase unida con microsílice como matriz.

Según la forma de la fase estacionaria, la cromatografía líquida se puede dividir en cromatografía en columna, cromatografía en papel y cromatografía en capa fina.Según la capacidad de adsorción, se puede dividir en cromatografía de adsorción, cromatografía de partición, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de permeación en gel.

En los últimos años, se ha agregado un sistema de flujo de líquido a alta presión al sistema de cromatografía en columna líquida para hacer que la fase móvil fluya rápidamente a alta presión para mejorar el efecto de separación, por lo que la cromatografía líquida de alta eficiencia (también conocida como alta presión) ha surgido.

PARTE
01 Principio del análisis cuantitativo de la cromatografía líquida

Para realizar una cuantificación cualitativa se necesitan sustancias puras como estándares;

La cuantificación por cromatografía líquida es un método relativamente cuantitativo: es decir, la cantidad del analito en la mezcla se estima a partir de una cantidad conocida de muestra estándar pura.

PARTE
02 Bases para la cuantificación por cromatografía líquida

La cantidad del componente medido (W) es proporcional al valor de respuesta (A) (altura del pico o área del pico), W=f×A.

Factor de corrección cuantitativa (f): Es la constante de proporcionalidad de la fórmula de cálculo cuantitativo, y su significado físico es la cantidad del componente medido representado por el valor de respuesta unitario (área de pico).

El factor de corrección cuantitativo se puede obtener a partir de la cantidad conocida de muestra estándar y su valor de respuesta.

Mida el valor de respuesta del componente desconocido y la cantidad del componente se puede obtener mediante el factor de corrección cuantitativa.

PARTE
03 Términos comunes en análisis cuantitativo

Muestra (muestra): una solución que contiene un analito para análisis cromatográfico.Dividido en muestras estándar y desconocidas.

Estándar: Un producto puro con una concentración conocida.Muestra desconocida (desconocida): La mezcla cuya concentración se va a probar.

Peso de la muestra: El peso original de la muestra a analizar.

Dilución: El factor de dilución de la muestra desconocida.

Componente: el pico cromatográfico que se va a analizar cuantitativamente, es decir, el analito cuyo contenido se desconoce.

Cantidad de componente (cantidad): el contenido (o concentración) de la sustancia a ensayar.

Integeridad: El proceso computacional de medir el área de un pico cromatográfico mediante una computadora.

Curva de calibración: una curva lineal del contenido del componente versus el valor de respuesta, establecida a partir de una cantidad conocida de sustancia estándar, utilizada para determinar el contenido desconocido del analito.

PARTE
04 Análisis Cuantitativo de Cromatografía Líquida

1. Seleccionar un método cromatográfico adecuado para el análisis cuantitativo:

l Confirmar el pico del componente detectado y lograr una resolución (R) superior a 1,5

l Determinar la consistencia (pureza) de los picos cromatográficos de los componentes probados.

l Determinar el límite de detección y el límite de cuantificación del método;sensibilidad y rango lineal

2. Establecer una curva de calibración con muestras estándar de diferentes concentraciones.

3. Verificar la exactitud y precisión de los métodos cuantitativos.

4. Utilice el software de gestión de cromatografía correspondiente para implementar la recolección de muestras, el procesamiento de datos y el informe de resultados.

PARTE
05 Identificación de picos cuantitativos (cualitativos)

Identificar cualitativamente cada pico cromatográfico a cuantificar.

Primero, utilice la muestra estándar para determinar el tiempo de retención (Rt) del pico cromatográfico que se va a cuantificar.Comparando el tiempo de retención, encuentre el componente correspondiente a cada pico cromatográfico en la muestra desconocida.El método cualitativo cromatográfico consiste en comparar el tiempo de retención con la muestra estándar.El criterio insuficienteconfirmación adicional (cualitativa)

1. Método de adición estándar

2. Utilice otros métodos al mismo tiempo: otros métodos cromatográficos (cambie el mecanismo, como: usar diferentes columnas cromatográficas), otros detectores (PDA: comparación de espectro, búsqueda de biblioteca de espectro; MS: análisis de espectro de masas, búsqueda de biblioteca de espectro)

3. Otros instrumentos y métodos

PARTE
06 Confirmación de la consistencia máxima cuantitativa

Confirmar la consistencia del pico cromatográfico (pureza)

Asegúrese de que solo haya un componente medido debajo de cada pico cromatográfico

Compruebe si hay interferencias de sustancias coeluyentes (impurezas)

Métodos para confirmar la consistencia del pico cromatográfico (pureza)

Comparación de espectrogramas con detectores de matriz de fotodiodos (PDA)

Identificación de pureza máxima

2996 Teoría del ángulo de pureza

Métodos cuantitativos comúnmente utilizados en la PARTE 07

Método de curva estándar, dividido en método estándar externo y método estándar interno:

1. Método estándar externo: más utilizado en cromatografía líquida

Se preparó una serie de muestras estándar de concentraciones conocidas utilizando muestras puras de los compuestos a ensayar como muestras estándar.inyectado en la columna hasta su valor de respuesta (área del pico).
Dentro de un cierto rango, existe una buena relación lineal entre la concentración de la muestra estándar y el valor de respuesta, es decir, W= f×A, y se crea una curva estándar.

Exactamente bajo las mismas condiciones experimentales, inyecte la muestra desconocida para obtener el valor de respuesta del componente a medir.Según el coeficiente f conocido se puede obtener la concentración del componente a medir.

Las ventajas del método estándar externo:operación y cálculo simples, es un método cuantitativo de uso común;no es necesario detectar y eluir cada componente;se requiere una muestra estándar;las condiciones de medición de la muestra estándar y la muestra desconocida deben ser consistentes;el volumen de inyección debe ser preciso.

Desventajas del método estándar externo:Se requiere que las condiciones experimentales sean altas, como que la sensibilidad del detector, el caudal y la composición de la fase móvil no se pueden cambiar;el volumen de cada inyección debe tener buena repetibilidad.

2. Método estándar interno: preciso, pero problemático, más utilizado en métodos estándar

Se añade una cantidad conocida del patrón interno al patrón para formar un patrón mixto y se prepara una serie de patrones de trabajo de concentración conocida.La relación molar entre estándar y estándar interno en el estándar mixto permanece sin cambios.Inyecte en la columna cromatográfica y tome (área del pico de la muestra estándar/área del pico de la muestra estándar interna) como valor de respuesta.De acuerdo con la relación lineal entre el valor de respuesta y la concentración del estándar de trabajo, es decir, W= f×A, se crea una curva estándar.

Se agrega una cantidad conocida de estándar interno a la muestra desconocida y se inyecta en la columna para obtener el valor de respuesta del componente que se va a medir.Según el coeficiente f conocido se puede obtener la concentración del componente a medir.

Las características del método de estándar interno:Durante la operación, la muestra y el estándar interno se mezclan y se inyectan en la columna cromatográfica, de modo que siempre que la relación entre la cantidad del componente medido y el estándar interno en la solución mezclada sea constante, el cambio del volumen de la muestra no afectará los resultados cuantitativos..El método del estándar interno compensa la influencia del volumen de la muestra, e incluso de la fase móvil y el detector, por lo que es más preciso que el método del estándar externo.

PARTE
08 Factores que afectan los resultados del análisis cuantitativo

La mala precisión puede deberse a:

Integración incorrecta del área del pico, descomposición de la muestra o impurezas introducidas durante la preparación de la muestra, vial de muestra no sellado, volatilización de la muestra o del disolvente, preparación incorrecta de la muestra, problemas de inyección de la muestra, preparación incorrecta del estándar interno

Posibles razones de la mala precisión:

Integración de picos incorrecta, problemas de inyección o inyector, descomposición de la muestra o impurezas introducidas durante la preparación de la muestra, problemas cromatográficos, respuesta degradada del detector