La cromatografía líquida es el método principal para probar el contenido de cada componente e impurezas en materias primas, productos intermedios, preparados y materiales de embalaje, pero muchas sustancias no cuentan con métodos estándar en los que confiar, por lo que es inevitable desarrollar nuevos métodos. En el desarrollo de métodos en fase líquida, la columna cromatográfica es el núcleo de la cromatografía líquida, por lo que elegir una columna cromatográfica adecuada es crucial. En este artículo, el autor explicará cómo elegir una columna de cromatografía líquida desde tres aspectos: ideas generales, consideraciones y ámbito de aplicación.
A.Ideas generales para seleccionar columnas de cromatografía líquida
1. Evaluar las propiedades físicas y químicas del analito: como estructura química, solubilidad, estabilidad (por ejemplo, si es fácil de oxidar/reducir/hidrolizar), acidez y alcalinidad, etc., especialmente la estructura química es la clave. factor para determinar las propiedades, como que el grupo conjugado tiene una fuerte absorción ultravioleta y una fuerte fluorescencia;
2. Determinar el propósito del análisis: si se requiere alta separación, alta eficiencia de la columna, corto tiempo de análisis, alta sensibilidad, alta resistencia a la presión, larga vida útil de la columna, bajo costo, etc.;
- Elija una columna cromatográfica adecuada: comprenda la composición, las propiedades físicas y químicas del relleno cromatográfico, como el tamaño de partícula, el tamaño de poro, la tolerancia a la temperatura, la tolerancia al pH, la adsorción del analito, etc.
- Consideraciones para seleccionar columnas de cromatografía líquida
Este capítulo discutirá los factores a considerar al seleccionar una columna de cromatografía desde la perspectiva de las propiedades físicas y químicas de la propia columna de cromatografía. 2.1 Matriz de relleno
2.1.1 Matriz de gel de sílice La matriz de relleno de la mayoría de las columnas de cromatografía líquida es gel de sílice. Este tipo de relleno tiene alta pureza, bajo costo, alta resistencia mecánica y grupos fáciles de modificar (como enlaces fenilo, enlaces amino, enlaces ciano, etc.), pero el valor de pH y el rango de temperatura que tolera son limitados: el El rango de pH de la mayoría de los rellenos de matriz de gel de sílice es de 2 a 8, pero el rango de pH de las fases unidas de gel de sílice especialmente modificadas puede ser tan amplio como de 1,5 a 10, y también hay fases unidas de gel de sílice especialmente modificadas que son estables a un pH bajo. como Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, que es estable a pH de 1 a 8; El límite de temperatura superior de la matriz de gel de sílice suele ser de 60 ℃, y algunas columnas de cromatografía pueden tolerar una temperatura de 40 ℃ a pH alto.
2.1.2 Matriz polimérica Las cargas poliméricas son principalmente poliestireno-divinilbenceno o polimetacrilato. Sus ventajas son que pueden tolerar un amplio rango de pH: se pueden utilizar en el rango de 1 a 14 y son más resistentes a las altas temperaturas (pueden alcanzar más de 80 °C). En comparación con los rellenos C18 a base de sílice, este tipo de relleno tiene una hidrofobicidad más fuerte y el polímero macroporoso es muy eficaz para separar muestras como las proteínas. Sus desventajas son que la eficiencia de la columna es menor y la resistencia mecánica es más débil que la de las cargas a base de sílice. 2.2 Forma de partícula
La mayoría de las cargas de HPLC modernas son partículas esféricas, pero a veces son partículas irregulares. Las partículas esféricas pueden proporcionar una presión de columna más baja, una mayor eficiencia de la columna, estabilidad y una vida más larga; cuando se utilizan fases móviles de alta viscosidad (como el ácido fosfórico) o cuando la solución de muestra es viscosa, las partículas irregulares tienen una superficie específica más grande, lo que favorece más la acción completa de las dos fases y el precio es relativamente bajo. 2.3 Tamaño de partícula
Cuanto menor sea el tamaño de las partículas, mayor será la eficiencia de la columna y mayor la separación, pero peor será la resistencia a la alta presión. La columna más utilizada es la columna de tamaño de partícula de 5 µm; si los requisitos de separación son altos, se puede seleccionar un relleno de 1,5 a 3 μm, lo que favorece la solución del problema de separación de algunas matrices complejas y muestras de múltiples componentes. UPLC puede utilizar rellenos de 1,5 μm; A menudo se utilizan cargas con un tamaño de partícula de 10 μm o mayor para columnas semipreparativas o preparativas. 2.4 Contenido de carbono
El contenido de carbono se refiere a la proporción de fase unida en la superficie del gel de sílice, que está relacionada con el área de superficie específica y la cobertura de la fase unida. El alto contenido de carbono proporciona una alta capacidad de columna y alta resolución, y a menudo se usa para muestras complejas que requieren una alta separación, pero debido al largo tiempo de interacción entre las dos fases, el tiempo de análisis es largo; Las columnas cromatográficas con bajo contenido de carbono tienen un tiempo de análisis más corto y pueden mostrar diferentes selectividades, y a menudo se usan para muestras simples que requieren un análisis rápido y muestras que requieren condiciones de fase acuosa altas. Generalmente, el contenido de carbono del C18 oscila entre el 7% y el 19%. 2.5 Tamaño de poro y área de superficie específica
Los medios de adsorción de HPLC son partículas porosas y la mayoría de las interacciones tienen lugar en los poros. Por tanto, las moléculas deben entrar en los poros para ser adsorbidas y separadas.
El tamaño de los poros y la superficie específica son dos conceptos complementarios. Un tamaño de poro pequeño significa una superficie específica grande y viceversa. Una gran superficie específica puede aumentar la interacción entre las moléculas de la muestra y las fases unidas, mejorar la retención, aumentar la carga de la muestra y la capacidad de la columna, y la separación de componentes complejos. A este tipo de masillas pertenecen las masillas totalmente porosas. Para aquellos con altos requerimientos de separación, se recomienda elegir masillas con gran superficie específica; una superficie específica pequeña puede reducir la contrapresión, mejorar la eficiencia de la columna y reducir el tiempo de equilibrio, lo cual es adecuado para el análisis de gradiente. A este tipo de rellenos pertenecen los rellenos core-shell. Bajo la premisa de garantizar la separación, se recomienda elegir rellenos con una superficie específica pequeña para aquellos con requisitos de alta eficiencia de análisis. 2.6 Volumen de poros y resistencia mecánica.
El volumen de poros, también conocido como "volumen de poros", se refiere al tamaño del volumen de huecos por unidad de partícula. Bien puede reflejar la resistencia mecánica del relleno. La resistencia mecánica de las masillas con un volumen de poros grande es ligeramente menor que la de las masillas con un volumen de poros pequeño. Los rellenos con un volumen de poros inferior o igual a 1,5 ml/g se utilizan principalmente para la separación por HPLC, mientras que los rellenos con un volumen de poros superior a 1,5 ml/g se utilizan principalmente para la cromatografía de exclusión molecular y la cromatografía de baja presión. 2.7 Tasa de limitación
La protección puede reducir los picos de cola causados por la interacción entre compuestos y grupos silanol expuestos (como enlaces iónicos entre compuestos alcalinos y grupos silanol, fuerzas de van der Waals y enlaces de hidrógeno entre compuestos ácidos y grupos silanol), mejorando así la eficiencia de la columna y la forma de los picos. . Las fases unidas sin tapar producirán selectividades diferentes en relación con las fases unidas con tapa, especialmente para muestras polares.
- Ámbito de aplicación de diferentes columnas de cromatografía líquida.
Este capítulo describirá el ámbito de aplicación de diferentes tipos de columnas de cromatografía líquida a través de algunos casos.
3.1 Columna cromatográfica C18 de fase reversa
La columna C18 es la columna de fase inversa más utilizada, que puede cumplir con las pruebas de contenido e impurezas de la mayoría de las sustancias orgánicas y es aplicable a sustancias de polaridad media, débilmente polares y no polares. El tipo y las especificaciones de la columna cromatográfica C18 deben seleccionarse de acuerdo con los requisitos de separación específicos. Por ejemplo, para sustancias con altos requisitos de separación, a menudo se utilizan especificaciones de 5 μm*4,6 mm*250 mm; para sustancias con matrices de separación complejas y polaridad similar, se pueden utilizar especificaciones de 4 μm*4,6 mm*250 mm o tamaños de partículas más pequeños. Por ejemplo, el autor utilizó una columna de 3 μm*4,6 mm*250 mm para detectar dos impurezas genotóxicas en celecoxib API. La separación de las dos sustancias puede llegar a 2,9, lo cual es excelente. Además, bajo la premisa de garantizar la separación, si se requiere un análisis rápido, se suele seleccionar una columna corta de 10 mm o 15 mm. Por ejemplo, cuando el autor utilizó LC-MS/MS para detectar una impureza genotóxica en el API de fosfato de piperaquina, se utilizó una columna de 3 μm*2,1 mm*100 mm. La separación entre la impureza y el componente principal fue de 2,0 y la detección de una muestra se puede completar en 5 minutos. 3.2 Columna de fenilo de fase reversa
La columna de fenilo también es un tipo de columna de fase reversa. Este tipo de columna tiene una fuerte selectividad por los compuestos aromáticos. Si la respuesta de los compuestos aromáticos medida con la columna C18 ordinaria es débil, puede considerar reemplazar la columna de fenilo. Por ejemplo, cuando estaba fabricando celecoxib API, la respuesta del componente principal medida por la columna de fenilo del mismo fabricante y la misma especificación (todos 5 μm*4,6 mm*250 mm) fue aproximadamente 7 veces mayor que la de la columna C18. 3.3 Columna de fase normal
Como complemento eficaz de la columna de fase inversa, la columna de fase normal es adecuada para compuestos altamente polares. Si el pico sigue siendo muy rápido al eluir con más del 90 % de fase acuosa en la columna de fase inversa, e incluso cerca del pico de disolvente y se superpone con él, puede considerar reemplazar la columna de fase normal. Este tipo de columna incluye columna hílica, columna amino, columna ciano, etc.
3.3.1 Columna hílica La columna hílica normalmente incorpora grupos hidrófilos en la cadena alquílica unida para mejorar la respuesta a sustancias polares. Este tipo de columna es adecuada para el análisis de sustancias azucaradas. El autor utilizó este tipo de columna al realizar el contenido y sustancias relacionadas de la xilosa y sus derivados. Los isómeros de un derivado de xilosa también pueden separarse bien;
3.3.2 Columna amino y columna de ciano La columna amino y la columna ciano se refieren a la introducción de modificaciones amino y ciano al final de la cadena alquílica unida, respectivamente, para mejorar la selectividad para sustancias especiales: por ejemplo, la columna amino es una buena opción para la separación de azúcares, aminoácidos, bases y amidas; La columna de ciano tiene mejor selectividad al separar sustancias estructurales similares hidrogenadas y no hidrogenadas debido a la presencia de enlaces conjugados. La columna amino y la columna ciano a menudo se pueden cambiar entre la columna de fase normal y la columna de fase inversa, pero no se recomienda el cambio frecuente. 3.4 Columna quiral
La columna quiral, como su nombre indica, es adecuada para la separación y análisis de compuestos quirales, especialmente en el campo de la industria farmacéutica. Este tipo de columna se puede considerar cuando las columnas convencionales de fase inversa y de fase normal no pueden lograr la separación de isómeros. Por ejemplo, el autor utilizó una columna quiral de 5 μm*4,6 mm*250 mm para separar los dos isómeros de la 1,2-difeniletilendiamina: (1S, 2S)-1, 2-difeniletilendiamina y (1R, 2R)-1, 2. -difeniletilendiamina, y la separación entre los dos alcanzó aproximadamente 2,0. Sin embargo, las columnas quirales son más caras que otros tipos de columnas, normalmente 1W+/pieza. Si es necesario este tipo de columnas, la unidad debe contar con un presupuesto suficiente. 3.5 Columna de intercambio iónico
Las columnas de intercambio iónico son adecuadas para la separación y análisis de iones cargados, como iones, proteínas, ácidos nucleicos y algunas sustancias azucaradas. Según el tipo de relleno, se dividen en columnas de intercambio catiónico, columnas de intercambio aniónico y columnas de intercambio catiónico fuerte.
Las columnas de intercambio catiónico incluyen columnas a base de calcio y de hidrógeno, que son principalmente adecuadas para el análisis de sustancias catiónicas como los aminoácidos. Por ejemplo, el autor utilizó columnas a base de calcio al analizar el gluconato de calcio y el acetato de calcio en una solución de lavado. Ambas sustancias tuvieron fuertes respuestas a λ=210 nm y el grado de separación alcanzó 3,0; el autor utilizó columnas a base de hidrógeno para analizar sustancias relacionadas con la glucosa. Varias sustancias importantes relacionadas (maltosa, maltotriosa y fructosa) tenían una alta sensibilidad bajo detectores diferenciales, con un límite de detección tan bajo como 0,5 ppm y un grado de separación de 2,0-2,5.
Las columnas de intercambio aniónico son principalmente adecuadas para el análisis de sustancias aniónicas como ácidos orgánicos e iones halógenos; Las columnas de intercambio catiónico fuerte tienen mayor capacidad de intercambio iónico y selectividad, y son adecuadas para la separación y análisis de muestras complejas.
Lo anterior es sólo una introducción a los tipos y rangos de aplicación de varias columnas de cromatografía líquida comunes combinadas con la propia experiencia del autor. Existen otros tipos especiales de columnas cromatográficas en aplicaciones reales, como columnas cromatográficas de poros grandes, columnas cromatográficas de poros pequeños, columnas de cromatografía de afinidad, columnas cromatográficas multimodo, columnas de cromatografía líquida de rendimiento ultra alto (UHPLC), columnas de cromatografía de fluidos supercríticos ( SFC), etc. Juegan un papel importante en diferentes campos. El tipo específico de columna cromatográfica debe seleccionarse según la estructura y propiedades de la muestra, los requisitos de separación y otros fines.
Hora de publicación: 14 de junio de 2024